Diplômée de l'Université d'Ohio, Piper Perabo part très rapidement s'installer à New York, où elle débute sa carrière. Après plusieurs courts-métrages, elle obtient son premier rôle en 2000 dans Whiteboys, de Marc Levin. Elle enchaîne ensuite avec la comédie Les Aventures de Rocky et Bullwinkle, dans laquelle elle donne la réplique à Robert De Niro et Rene Russo.
La même année, elle tient la vedette de Coyote Girls, qui lui vaudra la reconnaissance du public. Du film indépendant (Rebelles) à la comédie légère (saga "Treize à la douzaine") en passant par le thriller (Memories), Piper Perabo est l'incarnation même de l'actrice éclectique et donne la réplique à des acteurs confirmés tels que Kevin Spacey dans le film policier Edison ou encore Hugh Jackman et Scarlett Johansson dans Le Prestige, en 2006.
L'actrice s'essaie ensuite à un autre registre puisque dans Imagine Me and You, son coeur balance entre Matthew Goode et Lena Headey, qu'elle retrouve deux ans après La Crypte. En 2009, Piper Perabo participe à la comédie familiale Le Chihuahua de Beverly Hills, aux côtés de Jamie Lee Curtis.
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