Johnny Knoxville naît et grandit dans le sud des Etats-Unis, à Knoxville (d'où son nom de scène). Asthmatique, à 8 ans, il contracte un rhume, une pneumonie et une bronchite en même temps, et frôle la mort. De là naît son désir de profiter de chaque instant. Son esprit aventureux le mène en Californie où il suit des cours de comédie à l'American Academy of Dramatic Arts à Pasadena.
Il fait sa première apparition au cinéma dans un film de charme Desert Blues (1995). Cinq ans (un mariage, et une fille) plus tard, il fait de la figuration dans Coyote girls. Mais dans un premier temps, le cinéma n'est pas sa priorité.
Knoxville se passionne avant-tout pour la vitesse, notamment le skateboard, et écrit pour le magazine spécialisé Big Brother. Il propose de tester sur lui-même un équipement d'auto-défense, le tout filmé par un de ses collègues, Jeff Tremaine. C'est le début de l'émission Jackass diffusée en 2000 sur MTV. Imaginés par ce duo, aidé de Spike Jonze, les défis les plus stupides, douloureux et donc hilarants s'enchaînent : c'est un succès retentissant durant plus de deux ans.
Adoré par les enfants et les adolescents, qui tentent de reproduire ses exploits, Johnny Knoxville devient incontournable à Hollywood, qui lui donne carte blanche pour Jackass - le film en 2002, réalisé par son complice des débuts Jeff Tremaine. Barry Sonnenfeld le remarque et lui propose des apparitions dans Big trouble (2002) et MIIB . Il reprend même un rôle abandonné par Hugh Jackman dans The Grand theft Parsons (2003) avant d'apparaître aux côtés de The Rock dans Tolérance zéro (2004). Séduit par ce casse-cou, John Waters lui offre le rôle du gourou sexuel dans A dirty shame (2005).
Johnny Knoxville est désormais un candidat sérieux aux rôles-titre de comédies américaines à gros budget telle que The Dukes of Hazzard, l'adaptation de la série Shérif, fais-moi peur !. Il n'oublie pas pour autant ses premières amours, et joue l'un des précurseurs du skateboard dans Les Seigneurs de Dogtown (2005). En 2006, il retrouve ses complices casse-cou le temps de Jackass Deux - Le film, et, après quelques apparitions dans des séries télé, pour Jackass 3D (2010).
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