Fils d'un pasteur et d'une assistante sociale, James Masters passe son enfance en Californie. Très tôt passionné de théâtre, il joue dès le lycée dans de nombreuses pièces et comédies musicales avant de partir pour Los Angeles étudier au Pacific Conservatory of the Performing Arts. Afin d'enrichir son expérience, il passe ensuite par deux autres Universités : l'American Conservatory Theatre de San Francisco et l'Université de Julliard à New York.
Durant 10 ans, il se produit dans d'innombrables pièces de théâtre et en 1990, fonde même sa propre compagnie : le New Mercury Theatre. En 1992, Marsters décroche son premier rôle à la télévision, dans la série Bienvenue en Alaska, avant d'être enfin révélé au grand public à l'âge de 34 ans, grâce à Buffy contre les vampires (1997). A l'origine, le comédien n'est engagé que pour quelques épisodes mais, le public adhère tellement au personnage de Spike que Marsters interprète le vampire complexe et charismatique durant les sept saisons que dure la série. Une fois Buffy arrêtée, il continue même de porter le personnage dans son spin-off, Angel.
Féru des personnages ambigus, celui qui est également chanteur / compositeur met par la suite son talent à exécution dans de nombreuses autres séries. Détective dans FBI : portés disparus, machiavélique dans Smallville ou fauteur de troubles dans Torchwood, il va jusqu'à interpréter le sérial killer Ted Bundy dans The Capture of the Green River Killer. Jusqu'alors ignoré de l'industrie cinématgraphique, le comédien apparaît en 2007 dans la comédie dramatique P.S. I Love You aux côtés d'Hilary Swank avant de reprendre son masque de vilain en incarnant Piccolo dans son premier blockbuster : Dragonball Evolution.
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